Comment faire une solution saline tamponnée au phosphate

La solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est un mélange salé utilisé en recherche biologique. Il est utilisé pour diluer un groupe de cellules ou pour séparer les cellules. Ce tampon maintient un pH stable afin que les cellules ne soient pas détruites pendant leur examen et leur stockage. Vous pouvez créer une solution 1X qui peut être utilisée directement sur les cellules ou vous pouvez créer un stock 10X pouvant être dilué jusqu'à 1X. Si votre laboratoire utilise beaucoup de PBS, il peut être judicieux de créer un stock 10X car il durera plus longtemps.

Méthode One of Three:
Faire un stock 1X

1. 1 Rassemblez vos matériaux et ingrédients. Pour obtenir une solution 1X (la concentration normale utilisée pour les expériences) de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), vous aurez besoin d'un cylindre gradué de 1 L, d'une balance, d'un bécher de 2 L, d'un agitateur, d'une plaque d'agitation et d'un pH mètre, un autoclave et une bouteille en verre pour le stockage. Pour fabriquer 1 L de PBS, vous aurez besoin des quantités suivantes de chaque ingrédient:^[1]
   • De petites quantités de HCl dilué et / ou de NaOH au pH de la solution finale
   • 800 ml d'eau distillée
   • 8 g de NaCl (chlorure de sodium)
   • 0,2 g de KCl (chlorure de potassium)
   • 1,44 g de Na₂HPO₄ (phosphate disodique)
   • 0,24 g de KH₂PO₄ (phosphate monopotassique)
   • Les concentrations finales de chaque composé doivent être de 137 mm NaCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 2,7 mM de KCl et un pH de 7,4.^[2]
2. 2 Placez le barreau d'agitation dans le bécher et placez le bécher sur le dessus de la plaque à mélanger. Lorsque vous apportez une solution, vous souhaitez que la solution soit constamment en mouvement. Cela aidera à tout dissoudre plus rapidement. Pour éviter les éclaboussures une fois que vous avez ajouté de l'eau, placez la barre d'agitation dans le bécher vide puis placez-la sur la plaque à mélanger.^[3]
   • Une barre d'agitation contient un aimant qui permet à la barre de tourner et d'agiter la solution lorsqu'un récipient de liquide est placé sur la plaque d'agitation, qui contient un moteur.^[4]
   • Attendez qu'il y ait une solution dans le bécher avant de l'allumer.
3. 3 Mesurer 800 ml d'eau distillée dans le bécher de 2 litres, puis allumer la plaque d'agitation. Lors de la préparation d'une solution, commencez avec moins que le volume final d'eau. À la fin, vous ajouterez le reste de l'eau pour porter le volume total à 1 L. À l'aide de l'éprouvette graduée, mesurez 800 ml d'eau et versez-la directement dans un bécher propre.^[5]
   • Avec l'eau dans le bécher, allumez la plaque d'agitation à une vitesse moyenne. Vous devriez voir un petit tourbillon dans l'eau pendant que la barre de brassage commence à tourner.
4. 4 Peser les quantités appropriées de chaque produit chimique. Peser 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄et 0,24 g de KH₂PO₄. Utilisez la balance pour peser chaque produit chimique un par un dans ses propres bateaux de pesage.^[6]
   • Si vous ajoutez trop de produit chimique, retirez-en simplement l'excédent jusqu'à obtenir la quantité appropriée.
5. 5 Ajouter tous les produits chimiques à la solution et dissoudre. Verser chaque produit chimique dans l'eau en remuant. Il n'y a pas d'ordre spécial pour ajouter chacun, vous pouvez donc tout ajouter en une seule fois. Laissez tout continuer à remuer jusqu'à ce qu'il soit complètement dissous.^[7]
   • Vous pouvez laisser cela reposer pendant que vous faites autre chose et le vérifier plus tard. Il faudra au moins 5 à 10 minutes pour se dissoudre.
6. 6 Ajuster le pH de la solution à 7,4. Une fois que tout est complètement dissous, vous devez ajuster le pH du tampon jusqu'à ce qu'il atteigne 7,4.^[8] Maintenez la barre d'agitation et placez le pH-mètre dans la partie supérieure de la solution. Laissez les chiffres sur le pH-mètre cesser de bouger. La solution sera probablement trop acide, vous devrez donc ajouter de l'hydroxyde de sodium (NaOH) pour ajuster le pH.
   • Utilisez une petite pipette pour ajouter quelques gouttes de NaOH à la fois. Après chaque ajout, laisser la solution remuer un instant et vérifier la nouvelle lecture sur le pH-mètre.
   • Ajuster le pH d'une solution est un processus qui demande de la patience. Si vous passez accidentellement au-dessus de 7,4, vous pouvez ajouter quelques gouttes d'acide chlorhydrique (HCl) pour le ramener.
7. 7 Complétez l'eau jusqu'à ce que la solution soit de 1 litre. Une fois le pH correctement ajusté, vous pouvez amener votre solution au volume final de 1 litre. Versez soigneusement la solution complète du bécher dans le cylindre gradué de 1 L. Ajouter suffisamment d'eau distillée pour obtenir 1 L.^[9]
   • Verser la solution finale dans une bouteille en verre de 1 L pour l'autoclavage.
8. 8 Stériliser la solution dans un autoclave. Placez le couvercle sur la bouteille, mais ne le vis pas. Pendant l'autoclavage, la pression dans la bouteille peut s'accumuler et exploser si vous serrez le couvercle. Placez une bande de ruban autoclave sur le couvercle pour le maintenir en place pendant l'autoclavage.^[10]
   • Réglez l'autoclave pour stériliser pendant 20 minutes à 15 psi sur le cycle liquide.^[11]
   • La bande d'autoclave contient un indicateur de température. Si le ruban autoclave ne noircit pas lorsque le processus est terminé, l'autoclave n'est pas suffisamment chaud et vous devrez le stériliser à nouveau.
9. 9 Conservez le PBS à température ambiante. Après l'autoclavage, laissez le PBS refroidir à température ambiante, puis serrez le couvercle pour empêcher les contaminants de pénétrer. Serrer le couvercle avant que la bouteille ne refroidisse peut créer un vide et rendre très difficile le retrait ultérieur du couvercle. Le PBS est stable à température ambiante.^[12]
   • Vous pouvez également aliquoter le PBS dans des conteneurs plus petits pour les utiliser un par un.

Méthode deux sur trois:
Faire un stock 10X

1. 1 Recueillez vos matériaux et ingrédients. Faire le stock 10X (dix fois la concentration normale utilisée) est presque identique à celui du stock 1X, vous ajoutez simplement 10 fois plus de produits chimiques. Pour fabriquer le stock 10X, vous aurez besoin d'un cylindre gradué de 1 L, d'une balance, d'un bécher de 2 L, d'un agitateur, d'une plaque d'agitation, d'un pH-mètre, d'un autoclave et d'une bouteille en verre.^[13] Pour fabriquer 1 L, vous aurez besoin des quantités suivantes de chaque composé:^[14]
   • 700 ml d'eau distillée
   • 80 g de NaCl (chlorure de sodium)
   • 2 g de KCl (chlorure de potassium)
   • 14,4 g de Na₂HPO₄ (phosphate disodique)
   • 2,4 g de KH₂PO₄ (phosphate monopotassique)
   • Vous aurez également besoin de petites quantités de HCl et / ou de NaOH pour pH de la solution finale.
   • Les concentrations finales de chaque composé dans la solution 10X sont 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na.₂HPO₄et 18 mM KH₂PO₄.
2. 2 Placez le bécher sur la plaque d'agitation et ajoutez le barreau d'agitation. Pour aider à tout dissoudre rapidement, utilisez une barre d'agitation et une plaque pour maintenir la solution en mouvement constant. Placez la barre d'agitation dans le bécher vide avant de commencer à éviter les éclaboussures.^[15]
   • Attendez qu'il y ait une solution dans le bécher avant de remettre la plaque d'agitation.
3. 3 Mesurer 700 ml d'eau distillée dans le bécher de 2 litres, puis allumer la plaque d'agitation. Vous souhaitez commencer avec un volume inférieur au volume final, car le volume changera au fur et à mesure que vous y ajouterez les composés. Une fois que tout a été ajouté et dissous, vous allez ajouter le reste de l'eau pour porter le volume total à 1 L. Mesurer 700 ml d'eau avec le cylindre gradué et le verser directement dans un bécher propre.^[16]
   • Une fois l'eau ajoutée, allumez la plaque d'agitation à une vitesse moyenne. Vous devriez voir un petit tourbillon dans l'eau pendant que la barre de brassage commence à tourner.
4. 4 Peser les quantités appropriées de chaque produit chimique. Peser 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na₂HPO₄et 2,4 g de KH₂PO₄. Peser chaque produit chimique individuellement dans son propre bateau.^[17]
   • Si vous ajoutez trop de produit chimique, retirez-en simplement l'excédent jusqu'à obtenir la quantité appropriée.
5. 5 Dissoudre tous les produits chimiques dans la solution. Ajouter chaque produit chimique à l'eau pendant qu'il s'agite. Il n'y a pas d'ordre spécial pour ajouter chacun, vous pouvez donc tout ajouter en une seule fois. Continuer à remuer jusqu'à ce que toute la poudre soit complètement dissoute.^[18]
   • Il faudra au moins 5 à 10 minutes pour se dissoudre, alors laissez-le remuer et vérifiez-le plus tard.
6. 6 Assurez-vous que le pH de la solution est de 7,4. Avec tout complètement dissous, vous devez vérifier le pH du tampon et l'ajuster à 7,4.^[19] Maintenez la barre d'agitation et immergez la pointe du pH-mètre dans la partie supérieure de la solution. Laissez les chiffres sur le pH-mètre cesser de se déplacer pour mesurer le pH actuel. La solution sera probablement trop acide, vous devrez donc ajouter de l'hydroxyde de sodium (NaOH) pour le rendre plus basique.
   • Utilisez une petite pipette pour ajouter quelques gouttes de NaOH à la fois. Après chaque ajout, laisser la solution remuer un instant et attendre que les chiffres cessent de bouger. Continuez à ajouter NaOH jusqu'à ce que vous atteigniez 7,4.
   • PH une solution est un processus qui demande de la patience. Si vous passez accidentellement au-dessus de 7,4, vous pouvez ajouter quelques gouttes d'acide chlorhydrique (HCl) pour le ramener.
7. 7 Ajouter de l'eau pour rendre le volume final 1 litre. Avec le pH correctement ajusté, amener la solution au volume final de 1 litre. Versez soigneusement la solution complète du bécher dans le cylindre gradué de 1 L. Ajouter suffisamment d'eau distillée pour obtenir 1 L.^[20]
   • Verser la solution finale dans une bouteille en verre de 1 L pour l'autoclavage.
8. 8 Utilisez l'autoclave pour stériliser la solution. Placez le couvercle sur la bouteille, mais ne le vis pas complètement. Le processus d'autoclave produit de la vapeur qui peut provoquer une accumulation de pression dans la bouteille. Si le couvercle est serré, la bouteille peut exploser. Utilisez une bande de ruban autoclave sur le couvercle pour le maintenir en place pendant l'autoclavage.^[21]
   • Réglez l'autoclave pour stériliser pendant 20 minutes à 15 psi sur le cycle liquide.^[22]
   • La bande d'autoclave contient un indicateur de température. Si la température est correcte, le ruban noircira. Si le ruban ne devient pas noir, l'autoclave n'est pas assez chaud et vous devrez le stériliser à nouveau.
9. 9 Gardez le PBS stocké à température ambiante. Après l'autoclavage, laisser refroidir complètement le PBS avant de serrer le couvercle. Si vous serrez le couvercle alors qu'il est encore chaud, cela peut créer un vide qui rendra très difficile le retrait ultérieur du couvercle. Le PBS est stable à long terme à température ambiante.^[23]
   • Vous pouvez également aliquoter le PBS dans des conteneurs plus petits pour les utiliser un par un.

Méthode trois sur trois:
Dilution du stock 10X à 1X

1. 1 Déterminez la quantité de solution 1X dont vous aurez besoin. Tout d'abord, vous devez savoir combien de stock 1X vous voulez avant de pouvoir calculer le stock de 10X dont vous aurez besoin. Le montant à faire dépendra du type d’expérience que vous faites.
   • Si vous avez juste besoin d'une aliquote de bouillon 1X, faites environ 500 ml. Vous pouvez utiliser ce stock 1X pendant un certain temps et vous n'aurez pas à le faire aussi souvent.
2. 2 Calculez la quantité de stock 10X nécessaire. Pour calculer la quantité de stock 10X nécessaire, il vous suffit de diviser votre volume total par 10.^[24] Rappelez-vous que pour obtenir le volume correct, vos unités doivent correspondre: si le volume que vous effectuez est en millilitres, le volume que vous ajoutez sera en millilitres.
   • Par exemple: Si vous voulez 500 mL de solution, divisez 500 par 10 et vous obtenez 50 mL. Vous avez besoin de 50 mL de 10X pour obtenir 500 mL de 1X.
   • Par exemple: Si vous voulez 2 L de solution, divisez 2/10 et vous obtenez 0,2 L. Vous pouvez convertir ceci en mL en multipliant par 1000. Vous avez besoin de 200 mL de stock 10X pour obtenir 2 L de 1X.
3. 3 Soustrayez le volume 10X du volume total. Pour déterminer la quantité d'eau nécessaire pour diluer le stock 10X, il vous suffit de soustraire le volume 10X calculé du volume total souhaité.^[25]
   • Par exemple: Pour faire 500 ml, vous avez besoin de 50 ml de 10X de stock. Puisque 500 - 50 = 450, vous avez besoin de 450 ml d’eau distillée pour diluer le bouillon.
4. 4 Diluer le stock 10X avec de l'eau distillée. En utilisant les volumes que vous avez calculés, ajoutez de l'eau distillée au stock 10X. Vous avez maintenant créé 1 stock de PBS.^[26]
   • Par exemple, ajouter 50 mL de 10X de réserve à 450 mL d’eau distillée pour obtenir 1 x stock de PBS. Agiter le récipient pour mélanger la solution.
5. 5 Vérifiez le pH du stock 1X. Parfois, le processus de dilution affecte le pH du tampon. Il est prudent de vérifier le pH du stock 1X et de s’assurer qu’il se situe à 7,4 après la dilution.^[27]
   • Utilisez le pH-mètre pour mesurer le pH et utilisez HCl ou NaOH pour corriger le tampon à un pH de 7,4.