L'isolement des cellules est un processus courant réalisé dans de nombreuses classes et laboratoires de biologie. Les maladies cardiaques étant répandues dans le monde entier, de nombreux laboratoires étudient actuellement le cœur. Isoler les cellules cardiaques est un processus simple, facile à apprendre.

Première partie de cinq:
Préparer les solutions

  1. 1 Faire un tampon de perfusion. Le tampon de perfusion est la base de toutes les solutions utilisées dans le processus d'isolement. Le tampon ne contient que du glucose ajouté. Le glucose fournit une source d'énergie aux cellules lorsqu'elles sont ex vivo.
    • Mesurer 500 ml de solution tampon de perfusion (PB) 1X dans un cylindre gradué.
    • Verser le PB dans un bécher de 600 ml.
    • Ajouter 0,500 grammes de glucose à la solution.
    • Placez le bécher sur une plaque à mélanger.
    • Placez une barre d'agitation magnétique sur le fond du bécher.
    • Allumez la plaque d'agitation et remuez la solution jusqu'à ce que tout le glucose ait été dissous.
  2. 2 Faites une solution d'arrêt. Les cellules seront ensuite placées dans la «solution d'arrêt», ce qui empêchera l'enzyme de dégrader davantage les cellules.
    • Séparer 18 mL de PB dans un tube à falcon de 50 mL.
    • Ajouter 2 ml de sérum fœtal bovin (SVF) à la solution.
    • Ajouter 25 ul de CaCl2 10 mM à la solution.
    • Faites pivoter le tube de faucon trois fois pour mélanger la solution.
  3. 3 Faire une solution de perfusion. Le BDM est un inhibiteur croisé qui empêche les cellules de se contracter ou de battre et qui est utilisé pour préserver la santé et la structure des cellules. La solution de perfusion est un tampon de perfusion additionné de BDM.
    • Dans le PB restant, ajoutez 0,463 gramme de monoxyde de butadiène-2,3 (BDM).
    • Agiter la solution sur une plaque d'agitation jusqu'à ce que le BDM soit complètement dissous.
  4. 4 Faire un tampon de digestion. La collagénase est une enzyme qui décompose spécifiquement le collagène dans le cœur, libérant les cellules cardiaques des tissus.
    • Séparer 150 ml de solution de perfusion dans un bécher de 250 ml.
    • Ajouter 32 ul de CaCl2 100 mM à la solution.
    • Ajouter 0,100 grammes de collagénase de type II à la solution.
    • Agiter la solution sur une plaque d'agitation jusqu'à ce que la collagénase soit complètement dissoute.

Deuxième partie de cinq:
Effectuer la canulation

  1. 1 Mettre en place la canule.
    • Faire une canule en coupant un demi-pouce de la pointe d'une aiguille.
    • Visser la canule dans le fond d'une seringue de 5 ml.
    • Remplir la seringue de 5 ml avec une solution de perfusion.
    • Remplir un bateau de pesée avec une solution de perfusion.
    • Placez l'extrémité de la canule dans le bateau de pesage rempli.
    • Bouclez deux sutures attachées autour du bas de la canule.
  2. 2 Cannuler le coeur. L'aorte est l'artère principale du cœur qui fournit du sang oxygéné au système circulatoire.
    • En utilisant deux pinces, placez le cœur de rat extrait dans le plateau de pesée.
    • Tirez l'aorte vers le haut et sur l'extrémité de la canule.
    • Attachez deux sutures autour de l'aorte, fixant le cœur à la canule.

Troisième partie de cinq:
Effectuer une perfusion de Langendorff

  1. 1 Configurez le système Langendorff. Le système de perfusion Langendorff utilise une perfusion rétrograde qui pousse le fluide dans l'aorte vers le cœur, où le tampon de digestion décompose le tissu cardiaque pour libérer les cellules.
    • Remplir une seringue de 60 mL avec 50 mL de solution de perfusion.
    • Remplir une autre seringue de 60 ml avec 60 ml de tampon de digestion.
  2. 2 Perfuse le coeur. Le cœur doit avoir une couleur de chair légère après la digestion.
    • Vissez la canule dans le fond du système Langendorff.
    • Écoulement direct de la solution de perfusion vers le cœur jusqu'à ce que le cœur dégoutte de liquide clair.
    • Flux direct du tampon de digestion au cœur.
    • Gardez le tampon de digestion en circulation jusqu'à ce que le cœur devienne mou, ce qui prendra environ 10 à 12 minutes.

Partie quatre de cinq:
Effectuer la dissection

  1. 1 Retirez le cœur de la canule. Les ciseaux recouverts de céramique empêchent la déstabilisation de la membrane dans le cœur, ce qui pourrait entraîner la mort cellulaire.
    • Retirez la canule du système de perfusion et sur une serviette en papier.
    • En utilisant des ciseaux et des pinces recouverts de céramique, coupez le haut du cœur pour le retirer de la canule.
  2. 2 Diviser le cœur en trois sections.
    • En tenant le coeur avec une pince, utilisez des ciseaux pour couper et séparer le ventricule droit (RV), la paroi intraventriculaire (IV) et le ventricule gauche (LV).
    • Le LV sera le plus gros morceau et le RV sera le plus petit morceau.

Partie cinq de cinq:
Isoler les cellules

  1. 1 Mettre en place les gobelets dans un bain d'eau. Le maintien d'une température physiologique aide à prévenir la dégradation des tissus et des cellules.
    • Remplir six béchers de 5 mL avec 750 μl de tampon de digestion et les placer dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.
    • Étiquetez chaque bécher en fonction de l'endroit où il a été prélevé, soit du VR, IV ou LV. Il devrait y avoir 2 gobelets par RV, IV et LV.
  2. 2 Acquérir les cellules. La nébulosité de la solution indique que des cellules ont été libérées des tissus.
    • Placez chaque morceau de tissu dans l'un de ses gobelets étiquetés.
    • À l'aide de ciseaux à revêtement céramique, décollez délicatement le tissu.
    • Placez les ciseaux fermés au centre du tissu.
    • Déplacez les lames de ciseaux pour former une position en X.
    • Répétez le mouvement, en étendant les lames d'un côté à l'autre, jusqu'à ce que le tampon de digestion dans le bécher devienne nuageux.
  3. 3 Transférez les morceaux de tissu dans le deuxième ensemble de béchers.
    • À l’aide de pinces revêtues de céramique, transférez les morceaux de tissu tannés dans le deuxième ensemble de béchers étiquetés.
  4. 4 Transférer les cellules dans un tube Eppendorf étiqueté.
    • Étiquetez chaque tube Eppendorf avec RV, IV ou LV. Il y aura 6 tubes BT, 6 tubes IV et 6 tubes RV pour un total de 18 tubes.
    • Remplir chaque tube Eppendorf avec 750 ul de solution d'arrêt.
    • Transférer la solution de cellules dans le bécher du tampon de digestion dans un tube étiqueté.
  5. 5 Répétez le processus. Rappelez-vous qu'un total de dix-huit tubes sera utilisé.
    • Répétez la partie 5 étapes deux, trois et quatre pour chaque morceau de tissu six fois.
  6. 6 Terminez le processus d'isolement.
    • Après avoir transféré les cellules dans leurs tubes Eppendorf étiquetés, le processus d'isolation cellulaire est terminé.
    • Les cellules cardiaques saines seront droites et longues avec des stries claires.
    • Les cellules mortes seront froissées et circulaires.