L'identification des bactéries est un processus complexe. C'est en partie parce qu'il y a tellement de types: les estimations du nombre d'espèces vont d'environ 10 000 à plus d'un milliard![1] Être capable d'identifier correctement les bactéries est particulièrement important dans les milieux cliniques, car un traitement approprié peut dépendre du type de bactérie à l'origine d'une infection. Dans la plupart des cas, l'identification des bactéries est un processus d'élimination. Pour identifier les bactéries, utilisez des techniques de coloration, notez l’aspect des bactéries et observez comment les bactéries réagissent aux différentes conditions. Pour déterminer rapidement l’espèce exacte des bactéries, envoyez un échantillon pour le test ADN.

Méthode One of Four:
Identification des bactéries avec coloration de Gram

  1. 1 Utilisez la coloration de Gram pour voir si les bactéries sont Gram positif ou Gram négatif. La coloration de Gram est une procédure qui vous permet de diviser les bactéries en 2 types courants: Gram positif et Gram négatif. Les bactéries à Gram positif ont une paroi cellulaire très épaisse (constituée d'un polymère appelé peptidoglycane) qui retient mieux les taches de colorant que les parois plus minces des bactéries à Gram négatif.[2]
    • Les genres courants de bactéries à Gram positif comprennent les staphylocoques, les streptocoques, les microcoques et la listeria.[3]
    • Les genres de bactéries à Gram négatif courants comprennent Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacteriaceae, Haemophilus, Vibrio, Campylobacter et Fusobacterium.[4]
  2. 2 Utilisez des précautions de sécurité. Les bactéries et les produits chimiques que vous manipulerez pendant une procédure de coloration de Gram sont tous potentiellement dangereux. Portez des lunettes de protection, des gants jetables en nitrile et une blouse de laboratoire lors de l'exécution de la tâche. Mettez vos gants jetables et tout autre déchet contaminé dans un sac contenant des risques biologiques lorsque vous avez terminé. Suivez les procédures de votre laboratoire pour éliminer le sac de protection biologique.[5]
  3. 3 Faites une diapositive de votre échantillon bactérien. Pour commencer le processus, placez une petite goutte ou un morceau de votre échantillon bactérien sur une lame stérile. Passer la lame à travers la flamme d'un bec Bunsen 3 fois pour chauffer l'échantillon.[6] Cela empêchera l'échantillon de se laver lorsque vous ajoutez des réactifs ou rincez la lame.
  4. 4 Ajouter 5 gouttes de cristal violet à la lame. Placez les gouttes de colorant cristal violet sur la culture fixée à la chaleur. Laisser l'échantillon tremper dans le colorant cristal violet pendant 1 minute.[7]
    • Pour éviter de tacher votre main, vous pouvez tenir la lame en place avec une épingle à linge.[8]
  5. 5 Rincer doucement la lame pour enlever la tache. Utilisez un jet d'eau très doux provenant d'un évier ou d'une bouteille d'eau. Ne pas rincer pendant plus de 5 secondes.[9] Ce processus supprimera tout colorant qui n'est pas lié à l'échantillon.
  6. 6 Ajouter 5 gouttes d'iode de Gram à la lame. L'iode de Gram est une solution d'iode, d'iodure de potassium et de bicarbonate de sodium.[10] Cette solution fera fusionner le colorant violet cristallisé aux parois cellulaires des bactéries. Ajouter environ 5 gouttes et laisser reposer 1 minute.[11]
  7. 7 Rincer l'échantillon avec de l'alcool ou de l'acétone. L'alcool et l'acétone sont des agents décolorants. Si votre bactérie est une souche Gram négative, ces agents élimineront la tache des parois cellulaires bactériennes. Laissez couler quelques gouttes de l'agent décolorant sur l'échantillon et laissez-le reposer pendant moins de 3 secondes. Rincer doucement avec de l'eau pendant moins de 5 secondes pour éliminer l'alcool ou l'acétone.[12]
    • Si vous laissez l’agent décolorant reposer sur l’échantillon trop longtemps, il risque d’éliminer la tache des bactéries à Gram positif, entraînant un faux résultat négatif à Gram.
  8. 8 Contre la solution avec la safranine. La safranine est un colorant rouge, qui agit comme un colorant contre le cristal violet et teint les bactéries qui ne contiennent pas le colorant violet. Ajouter environ 5 gouttes de solution de safranine à l'échantillon et laisser reposer pendant 1 minute. Rincer très doucement avec de l'eau pendant 5 secondes.[13]
  9. 9 Visualisez votre échantillon au microscope à un grossissement de 1000X. Si les bactéries sont une souche Gram positive, elles apparaîtront violettes ou violettes au microscope. Les bactéries à Gram négatif apparaîtront en rouge à partir du contre-colorant de la safranine.[14]

Méthode deux sur quatre:
Utilisation de la technique de teinture Ziehl-Neelsen

  1. 1 Utilisez la coloration Ziehl-Neelsen pour détecter les bactéries acido-résistantes. Les bactéries acidophiles contiennent une quantité de lipides plus élevée que les autres types de bactéries, ce qui les rend résistantes aux colorants utilisés dans la coloration de Gram. Les bactéries acidophiles appartiennent au genre Mycobacterium, qui comprend la bactérie responsable de la tuberculose (M. tuberculosis). Les bactéries acido-résistantes peuvent être colorées avec un colorant carbol-fuchsine rouge, qui résiste à un rinçage avec une solution d'alcool acide ou d'acide sulfurique.[15]
  2. 2 Prenez les précautions de sécurité appropriées. Les produits chimiques et biologiques utilisés lors d'une procédure de coloration de Ziehl-Neelsen peuvent être dangereux. Vous utiliserez également des sources de chaleur, comme un bec Bunsen, une lampe à alcool ou un radiateur électrique. Prenez les précautions suivantes lors de l'exécution de cette procédure:[16]
    • Porter des lunettes de protection, des gants en nitrile et une blouse de laboratoire.[17]
    • Veillez à ne pas inhaler les émanations des solutions de coloration et de décoloration, ou à les faire pénétrer sur votre peau ou dans vos yeux. Gardez tous les contenants ouverts sous une hotte.[18]
    • Faites très attention lorsque vous chauffez votre lame, car la plupart des produits chimiques que vous utilisez sont inflammables. Il peut également y avoir des traces de produits chimiques inflammables sur les supports de diapositives et autres équipements.[19]
  3. 3 Préparez une diapositive. Étaler un frottis de votre échantillon uniformément sur le centre d'une lame stérile, en effectuant des mouvements circulaires. Votre frottis devrait être d'environ 10 mm (0,4 pouce) sur 20 mm (0,8 pouce).[20]
  4. 4 Séchez votre diapositive. Placez la diapositive sur une grille de séchage vers le haut. Laisser sécher à l'air pendant 30 minutes.[21] N'essayez pas de sécher la lame.
  5. 5 La chaleur fixe votre frottis. Vous pouvez chauffer l'échantillon en faisant passer la lame au-dessus de la flamme d'un bec Bunsen 2 à 3 fois, vers le haut.Sinon, placez la lame sur un chauffe-plat électrique à 65 ° -75 ° C (149 ° -167 ° F) pendant au moins 2 heures.[22] Veillez à ne pas brûler ou faire bouillir l'échantillon.
  6. 6 Ajoutez la tache de carbol-fuchsin à votre diapositive. Mettre plusieurs gouttes de solution de carbol-fuchsine sur la lame. Ajouter suffisamment pour couvrir complètement le frottis.[23]
  7. 7 Chauffer la lame tachée pour fixer la tache au frottis. Chauffez délicatement la lame sur un bec Bunsen ou une lampe à alcool, frottez-la vers le haut ou placez-la sur un radiateur électrique. Chauffer la lame jusqu'à ce qu'elle atteigne 60 ° C (140 ° F). Vous devriez voir la vapeur commencer à monter. Laisser la tache chauffée reposer sur la lame pendant 5 minutes.[24]
    • Si vous utilisez un chauffe-glissière électrique, réglez-le sur 60 ° C (140 ° F). Si vous utilisez un bec Bunsen ou une lampe à alcool, vous devrez surveiller attentivement l'apparition de vapeur ou de vapeur.
    • Pour maintenir la lame à la température désirée pendant 5 minutes, appliquez la chaleur par intermittence.[25]
    • Veillez à ne pas faire bouillir, roussir ou sécher complètement votre frottis taché.
  8. 8 Rincez la lame avec de l'eau fraîche. Laisser refroidir la lame pendant environ 5 minutes, puis rincer délicatement pendant quelques secondes avec de l'eau propre d'un robinet ou d'un flacon pour éliminer toute tache qui n'est pas liée à l'échantillon.[26]
  9. 9 Couvrir le frottis avec de l'alcool acide ou de l'acide sulfurique. Ajouter suffisamment de volume de 3% sur le volume (v / v) d'alcool acide ou d'acide sulfurique à 20% pour couvrir complètement le frottis. Laisser l'acide sur la lame jusqu'à ce que la tache soit passée à un rose très pâle.[27] Cela prend généralement au moins 10 minutes.[28]
  10. 10 Rincer la lame avec de l'eau propre. Rincer doucement avec de l'eau du robinet ou du flacon à pression, en veillant à éliminer tout acide et toute trace de colorant.[29]
  11. 11 Ajouter un contraste à la diapositive. Une fois la lame rincée, couvrez votre tache de vert malachite ou de solution de bleu de méthylène Loeffler. Ces solutions créent un «arrière-plan» vert ou bleu qui aide les bactéries colorées en rouge à se démarquer et qui tachera également toute autre matière biologique présente sur la lame (comme les cellules humaines et les bactéries non acides). Laissez la tache reposer pendant 1-2 minutes.[30]
  12. 12 Rincez et séchez la lame. Laver la lame délicatement avec de l'eau propre pour éliminer tout excès de colorant. Lorsque vous avez terminé, essuyez l'arrière de la diapositive avec un chiffon propre et placez la diapositive sur une grille pour sécher à l'air.[31]
  13. 13 Examiner la lame sous un microscope à un grossissement de 1000X. Les bactéries acides rapides devraient apparaître en rouge ou en rose. Les bactéries non acides-rapides, les cellules non-bactériennes, et le fond apparaîtra bleu ou vert.[32]

Méthode trois sur quatre:
Observation de l'apparence et du comportement bactériens

  1. 1 Observez la forme des bactéries. Une fois que vous avez utilisé la coloration pour déterminer si votre bactérie est Gram positif, Gram négatif ou acide rapide, il est temps de réduire le type de bactérie. La première étape consiste à observer la forme des bactéries sur la lame. Les trois formes les plus communes sont le coccus (sphérique), le bacille (en forme de tige) et la spirale.[33]
    • Il existe de nombreuses variantes sur toutes ces formes. Par exemple, les bactéries du coccus peuvent apparaître dans diverses formations, telles que les paires fusionnées (diplococcus), les chaînes, les grappes ou les groupes de 4 (tétrades).
  2. 2 Déterminez si les bactéries sont aérobies ou anaérobies. Prenez 2 échantillons de bactéries et créez 2 cultures distinctes. 1 culture doit être anaérobie (cultivée sans oxygène) et l'autre doit être aérobie (cultivée avec de l'oxygène). Conservez votre culture anaérobie dans un environnement exempt d'oxygène à 35 ° C (95 ° F) pendant au moins 48 heures avant d'essayer d'observer la croissance bactérienne.[34]
    • Si vos bactéries se développent dans un environnement sans oxygène, mais pas lorsqu'elles sont exposées à l'oxygène, elles sont anaérobies.
    • Les bactéries qui se développent lorsqu'elles sont exposées à l'oxygène, mais pas lorsqu'elles sont conservées dans un environnement exempt d'oxygène, sont aérobies.
    • Les bactéries qui peuvent se développer dans les deux environnements sont appelées anaérobies facultatifs.
  3. 3 Faites un test de motilité pour savoir si vos bactéries sont mobiles. Les bactéries motiles peuvent se déplacer seules en utilisant un ou plusieurs flagelles pour se propulser. La motilité, ou le manque de motilité, peut être un facteur important dans l'identification d'une souche de bactéries.[35] Il existe plusieurs types de tests de motilité, mais le test du milieu semi-solide est le plus sûr et le plus facile à lire.
  4. 4 Créez une culture pour votre test de motilité. Préparer une culture de bactéries dans un bouillon nutritif. Préparez le bouillon selon les instructions de votre milieu de bouillon préféré.[36]
  5. 5 Inoculer un tube de gélose semi-solide avec votre culture. Enduire une aiguille d'inoculation stérile avec une partie de la culture de bouillon. Soigneusement poignarder l'aiguille directement dans un tube de gélose semi-solide formulé pour le test de motilité (comme l'agar TTC). L'aiguille devrait atteindre environ les 2/3 de la gélose.[37]
    • Lorsque vous avez terminé, retirez l’aiguille avec précaution en veillant à ne pas casser la
    • Incuber le tube à 30 ° C (86 ° F) pendant 48 heures.[38]
  6. 6 Lisez les résultats du test de motilité. La gélose de la motilité devient rouge quand elle entre en contact avec des bactéries. Si vos bactéries sont mobiles, une couleur rouge ou rose sera diffusée dans la gélose. S'ils ne sont pas mobiles, vous ne verrez que la couleur rouge le long de la ligne de trait d'origine.[39]

Méthode quatre sur quatre:
Mettre tous ensemble

  1. 1 Mettez vos observations ensemble. Pour limiter le genre de bactéries, vous devrez combiner les informations de vos taches, cultures et observations de la forme bactérienne. Si vous testez une culture à partir d'un patient, des informations sur leurs symptômes peuvent également être utiles pour réduire le champ.[40]
    • Par exemple, si vos tests révèlent que vos bactéries sont des bacilles Gram négatif, anaérobies et non mobiles, et qu'elles sont associées à des douleurs abdominales, des nausées et des vomissements chez le patient, elles sont probablement Bacteroides fragilis.[41]
  2. 2 Consulter une base de données de bactéries. Comme il y a tellement d'espèces de bactéries, il est impossible de les mémoriser ou de les reconnaître toutes seules. Vous devrez probablement consulter un manuel de microbiologie clinique ou une base de données en ligne et rechercher des bactéries présentant toutes les caractéristiques de votre échantillon.
    • Parmi les bonnes ressources en ligne pour l'identification des bactéries, citons le Centre d'intégration des ressources Pathosystems (patricbrc.org) et la base de données Pathogen Bacteria sur GlobalRPh (globalrph.com/bacterial-strains.htm).
  3. 3 Utilisez des tests génétiques pour déterminer les espèces exactes de bactéries. Dans certains cas, il peut être nécessaire d'identifier l'espèce exacte des bactéries. La méthode la plus rapide et la plus efficace consiste à effectuer des tests d’ADN. Les tests ADN sont également utiles pour identifier les bactéries qui résistent aux formes traditionnelles de culture ou de coloration.[42] Les tests ADN microbiens modernes peuvent être effectués très rapidement, parfois en 2 heures seulement.[43]
    • Si vous n'avez pas accès à un laboratoire de séquençage du génome microbien, envoyez un échantillon à un centre spécialisé, tel que MIDI Labs ou CD Genomics.